Tách chiết và tinh sạch enzyme glucose oxidase từ chủng vi nấm Aspergillus Niger MN1

Tóm tắt

Trong nghiên cứu, glucose oxidase (GOx) được thu nhận từ chủng nấm sợi Aspergillus niger MN1 dưới dạng enzyme nội bào. Phương pháp phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm đã được lựa chọn cho trích ly enzyme. Enzyme được tinh chế bằng kết tủa (NH4)2SO4, thẩm tách, sắc kí trao đổi ion và sắc kí lọc gel với hoạt tính enzyme tinh khiết đạt 23,77 U/mg, hiệu suất thu hồi đạt 28,11% và mức độ tinh sạch gấp 83,4 lần so với ban đầu. Enzyme thu được có trọng lượng phân tử 160 kDa, hoạt tính ổn định trong điều kiện acid nhẹ (pH 4,5-6) và nhiệt độ vừa phải (30-40°C). Enzyme này có ái lực tốt với glucose và khá bền vững với các ion kim loại phổ biến trong tự nhiên. Nó bị ức chế hoàn toàn bởi AgNO3 và L-Cysteine. Enzyme GOx - MN1 không chứa mycotoxin mở ra tiềm năng lớn trong việc ứng dụng làm phụ gia thực phẩm hoặc thành phần trong các thiết bị cảm biến sinh học đòi hỏi tiêu chuẩn an toàn khắt khe.

Từ khóa: Aspergillus niger, enzyme, glucose oxydase, tách chiết, tinh sạch.

EXTRACTION AND PURIFICATION OF GLUCOSE OXIDASE ENZYME FROM ASPERGILLUS NIGER MN1 STRAIN

Abstract

In this study, glucose oxidase (GOx) was successfully isolated from the filamentous fungus Aspergillus niger strain MN1 as an intracellular enzyme. Ultrasonic cell disruption was employed as the primary method for enzyme extraction. The enzyme was purified through a multi-stage process involving (NH4)2SO4 precipitation, dialysis, ion-exchange chromatography, and gel filtration chromatography. The purified enzyme achieved a specific activity of 23.77 U/mg, a recovery yield of 28.11%, and an 83.4-fold increase in purification compared to the crude extract. The purified GOx exhibited a molecular weight of approximately 160 kDa and demonstrated stable activity under mild acidic conditions (pH 4.5-6) and moderate temperatures (30-40°C). Furthermore, the enzyme displayed a strong affinity for glucose and remained relatively stable in the presence of common naturally occurring metal ions. Notably, the enzyme was completely inhibited by AgNO3 and L-Cysteine. Importantly, mycotoxin testing confirmed the biological safety of the enzyme, highlighting its significant potential for applications as a food additive or as a core component in biosensors that require stringent safety standards.

Keywords: Aspergillus niger, enzyme, extraction, glucose oxidase, purification.

JEL Classifications: O13, P18, P48

1. Đặt vấn đề

Glucose oxidase (E.C. 1.1.3.4) (GOx) là một enzyme oxyhoá khử, xúc tác cho quá trình oxy hóa β-D-glucose thành axit gluconic và hydrogen peroxide (H2O2). So với nhiều loại enzyme khác, GOx tương đối bền vững và có tốc độ phản ứng nhanh. GOx có thể hoạt động trong một khoảng pH rộng (thường từ 4,0 đến 7,0) và chịu được nhiệt độ ổn định. GOx còn có tính đặc hiệu cao với β-D-(+)-glucose do đó hoạt động ổn định trong các môi trường phức tạp mà không bị nhiễu bởi các chất khác. GOx là một glycoprotein (chứa khoảng 16% carbohydrate), lớp vỏ đường này giúp bảo vệ enzyme khỏi sự phân hủy tự nhiên, kéo dài tuổi thọ của enzyme khi lưu trữ (Vitolo, 2021).

GOx đã được tinh chế từ nhiều nguồn vi nấm, trong đó các chi Aspergillus và Penicillium được nghiên cứu nhiều nhất. GOx thu nhận từ A. niger được sử dụng phổ biến nhờ tính đặc hiệu cao (Pluschkell & cs, 1996, Zia & cs, 2007). GOx từ vi sinh vật hiện đang nhận được nhiều sự quan tâm do có khả năng ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực thực phẩm (loại bỏ glucose và oxy khỏi thực phẩm và đồ uống, cải thiện màu sắc và hương vị, ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh do đó tăng thời hạn sử dụng của thực phẩm...) (Tang & cs, 2016), chẩn đoán y tế (cảm biến để phát hiện và đo lượng glucose trong mẫu máu và nước tiểu), dược phẩm (dùng như một loại muối trong các thành phần hóa học của thuốc) (Bodade & cs, 2010), công nghệ sinh học môi trường (cảm biến đo lượng oxy hòa tan (DO) trong nước, định lượng chất ô nhiễm thông qua ức chế enzyme, đảm nhiệm vai trò chất xúc tác sinh học ở cực anode của pin sinh học) (Yoo & Lee, 2010)...

Tại Việt Nam các nghiên cứu và ứng dụng enzyme GOx vẫn còn hạn chế. Chủng vi nấm MN1 có hoạt tính sinh tổng hợp GOx được phân lập từ đất trồng lúa Việt Nam vì vậy có giá trị nội địa hóa nguồn enzyme. Bài báo này trình bày các kết quả nghiên cứu lựa chọn phương pháp tách chiết và tinh sạch để thu hồi hiệu quả enzyme GOx thu nhận từ chủng MN1.

2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1. Vật liệu nghiên cứu 

Chủng vi nấm MN1 có hoạt tính sinh tổng hợp GOx cao được tuyển chọn từ Bộ sưu tập chủng của Viện Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp nuôi cấy (Liu & cs, 1999)

Chủng MN1 được nuôi cấy cho sinh tổng hợp GOx trong 100 ml môi trường có thành phần (g/l): Glucose 100; KH2PO4 0,35; Ure 0,55; MgSO4 0,15; CaCO3 3,0; Nước cất (lít) 1,0; pH 6,2. Nuôi lắc 200 vòng/phút ở 30oC trong 3 ngày. 

2.2.2. Xác định hàm lượng protein tổng và hoạt tính enzyme (Kristensen, 1994)

Xác định hàm lượng protein tổng số: Trộn 20 μL mẫu với 1000 μL thuốc thử Bradford, sau 10 phút đo độ hấp thụ ở 595 nm. Đường chuẩn BSA được sử dụng để xác định nồng độ protein.
Đo hoạt độ enzyme GOx: Trộn 170 μL glucose 10% (w/v), 800 μL o-dianicidine (6,6 mg o-dianicidine/100 mL dung dịch đệm photphat 0,1 M pH 7), 30 μL peroxidase 60 U/mL và 30 μL enzyme cần đo, đo độ hấp thụ ở 436 nm. Hoạt độ enzyme được tính toán dựa trên đường chuẩn GOx. 

2.2.3. Đánh giá khả năng sinh độc tố nấm mycotoxin

Chiết độc tố từ dịch enzyme thô bằng methanol. Chấm mẫu thử và các mẫu chuẩn của Aflatoxin (B1, B2, G1, G2), Ochratoxin A lên bản mỏng silica gel. Chạy sắc ký có chứa hệ dung môi Toluene - Ethyl acetate - Axit formic (tỉ lệ 6:3:1). Soi vết sắc ký của mẫu dưới đèn tử ngoại UV 365 nm.

2.2.4. Định danh chủng vi nấm 

+ Dựa vào đặc điểm hình thái học và vi hình thái theo khóa phân loại vi nấm của Ainsworth & cs (1973). 

+ Định danh dựa trên trình tự gen ITS: Khuyếch đại gen bằng sử dụng cặp mồi ITS1: 5’ - CCGTAGGTGAACCTGCGG - 3’; ITS4: 5’ - CCTCCGCTTATTGATATGC - 3’. So sánh dữ liệu trình tự ADN với cơ sở dữ liệu NCBI GenBank. 

2.2.5. Nghiên cứu các điều kiện phá vỡ tế bào giải phóng enzyme GOx nội bào (Simpson & cs, 2007)

Dùng sóng siêu âm: Tần số 14 kHz, thời gian ngắt quãng 10 giây - nghỉ 20 giấy/10 phút, nhiệt độ 4oC. Ly tâm thu dịch nổi enzyme thô.

Dùng nitơ lỏng: Đổ nitơ lỏng lạnh ngập mẫu để đông cứng tế bào. Dùng chày nghiền mạnh theo vòng tròn. Vừa nghiền vừa bổ sung nitơ lỏng liên tục để đảm bảo mẫu luôn ở dạng bột khô nát. 
Dùng hóa chất: Sinh khối nấm được hòa vào dung dịch phá tế bào (50mM Tris-HCl; pH 7,5; 5,0 mM MgCl2; 10mM β- mercaptoethanol; 2,0 mM axit aminocaproic; 1,0 mM phenylmethylsulfonyl fluoride và 0,2 mM EDTA) với tỉ lệ 1:1. 

Dùng cơ học: Sinh khối nấm và bi thủy tinh Ø 0,5mm được trộn với tỷ lệ =1:1. Chạy máy 30 giây - nghỉ 60 giây, lặp lại từ 6 đến 10 lần ở 4oC. Ly tâm thu dịch chiết enzyme thô.

Phân tích thống kê: Kết quả thể hiện giá trị trung bình thu được từ ba lần thí nghiệm với độ sai lệch < 5%.

Dữ liệu được phân tích bằng phương pháp ANOVA sử dụng mô hình hồi quy tổng quát của phần mềm Statistica 8.0 (Statsof) trong quá trình nghiên cứu.

2.2.6. Kết tủa và tinh chế enzyme GOx 

(1) Tinh chế bằng kết tủa muối (Aninda & cs, 2018)

Chiết suất enzyme nội bào thô thu từ 50 ml dịch lên men được hòa tan trong 50 ml dung dịch đệm CH3COONa, pH 4,5, 0,1 M. (NH4)2SO4 được thêm vào ở các độ bão hòa 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90%. Khuấy trong 1,5 giờ, thu tủa bằng ly tâm, hòa lại trong 50 ml đệm phosphat 0,1 M pH 6. 
Dịch tủa được cho vào túi lọc có kích thước lỗ 12 kDa và thẩm tách trong 18 giờ ở 4°C với khuấy từ và 2 lần thay đổi đệm PBS 0,001 M pH 6 sau mỗi 6 giờ. Ly tâm để đẩy nước và muối qua màng lọc, enzyme được giữ lại. 

(2) Tinh chế bằng sắc ký (Jagdish & Neelum, 2013).

+ Sắc ký trao đổi ion: Cột DEAE-Cellulose (Cytiva, Mỹ) được xử lý lần lượt với HC1 và NaOH 0,5 mol/L/20 phút rồi cân bằng với đệm Tris-HCl 10 mmol/L (pH 6,9) qua đêm. Phần dịch đã thẩm tách được nạp vào cột DEAE-Cellulose (50 x 4 cm) sử dụng đệm phosphat, pH 6,0, 0,1 M với tốc độ dòng 40-50 mL/h và sau đó được rửa giải từng bước bằng Tris-HCl 10 mmol/L (pH 6,9) và NaCl có các gradient nồng độ khác nhau, ở tốc độ dòng 4 mL/phút. 
+ Sắc ký lọc gel: Cột Superdex-75 (Cytiva, Mỹ) được xử lý với NaOH nồng độ 0,2 mol/L/20 phút rồi cân bằng với dung dịch đệm NH4HCO3 0,15 mol/L (pH 8,5) qua đêm. Các phân đoạn hoạt tính thu được ở bước trước được nạp lên cột và sau đó rửa giải bằng dung dịch đệm NH4HCO3 0,15 mol/L (pH 8,5) với tốc độ dòng 0,5 mL/phút. 
Sau mỗi bước tinh chế tiến hành xác định độ tinh sạch, hàm lượng, hoạt độ của enzyme, tính toán hiệu suất thu hồi và hoạt độ riêng của enzyme GOx. 

2.2.7. Đánh giá đặc tính của enzyme tinh khiết (Camassola, 2013)

(1) Kiểm tra kích thước, trọng lượng phân tử, độ tinh sạch của enzyme: Các phân đoạn được trộn với dung dịch đệm 5X có chứa SDS, β-Mercaptoethanol, Glycerol và chất nhuộm màu Bromophenol Blue. Đun mẫu ở 100oC/ 10 phút để biến tính enzyme. Nhỏ mẫu vào các giếng của gel (Tris/Glycine + đệm Tris/Glycine/SDS, polyacrylamide 8%) đồng thời với Marker. Sau khi điện di 130V/60 phút, nhuộm Coomassie Brilliant Blue và soi dưới tia UV. 

(2) Xác định các thông số động học của enzyme Km và tốc độ cực đại của phản ứng Vmax bằng phương pháp đo quang, sử dụng phần mềm Excel để hồi quy phi tuyến trực tiếp theo phương trình Michaelis-Menten.

(3) Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, pH lên hoạt tính và độ bền của enzyme 

+ Độ bền nhiệt được đánh giá sau khi ủ enzyme trong dung dịch đệm natri axetat 0,1 M, pH ở 5,0 ở 30 đến 80°C trong 1 giờ, hoạt tính enzyme còn lại được xác định. Nhiệt độ tối ưu được cũng được kiểm tra ở thang nhiệt độ này. 
+ Giữ enzyme ở 4°C/1 h ở độ pH khác nhau (2-8) của dung dịch đệm 0,1 M và hoạt tính còn lại được tính toán bằng cách sử dụng các điều kiện xét nghiệm tiêu chuẩn. Các đệm khác nhau được sử dụng: đệm citrate (pH ở 2,0-3,5), đệm axetat (pH ở 4,0-5,5), đệm photphat (pH ở 6,0-7,5), đệm Tris-HCl (pH ở 7,5-8,0). Xác định pH tối ưu và độ bền pH 

(4) Nghiên cứu ảnh hưởng một số ion kim loại, chất ức chế lên hoạt tính enzyme

Đánh giá tác động của các ion kim loại (Ag+, Ca2+, Mg2+, Zn2+, Cu2+) và các chất ức chế (EDTA, SDS, Urea, L-Cysteine) lên hoạt tính enzyme. Ủ enzyme với các nồng độ ion kim loại/ chất ức chế khác nhau trong thời gian 1h ở 4°C. 

3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận 

3.1. Xác định hoạt tính sinh tổng hợp enzyme GOx và khả năng sinh độc tố của chủng vi nấm MN1

Chủng MN1 đã được tuyển chọn từ Bộ sưu tập chủng vi nấm có khả năng sản xuất GOx cao. Việc sản xuất GOx từ MN1 sử dụng môi trường lỏng chứa Ure, KH2PO4, MgSO₄, CaCO₃ và glucose. MgSO₄ được sử dụng ở nồng độ thấp, vì lượng ion Mg²⁺dư thừa sẽ làm giảm sản lượng GOx. CaCO₃ là chất cảm ứng được thêm vào để thúc đẩy sự hình thành GOx. Sau khi kết thúc quá trình lên men, dịch nuôi cấy được lọc tách riêng sinh khối sợi nấm. Xác định hoạt tính enzyme GOx thô ngoại bào và nội bào.

Chủng MN1 chủ yếu tích lũy GOx nội bào. Điều này được thể hiện qua hoạt tính enzyme nội bào cao hơn enzyme ngoại bào (khoảng 8,12 lần) (Hình 1a). Vì vậy, trong các bước tiếp theo, nhóm nghiên cứu tập trung vào nghiên cứu thu nhận enzyme nội bào từ chủng này. 

Trong sản xuất enzyme, độc tố nấm mốc (mycotoxins) là rào cản lớn nhất để ứng dụng vào công nghệ thực phẩm và dược phẩm. Aflatoxin B1; B2; G1; G2 ngoài việc gây ngộ độc cấp tính (liều gây chết ~ 10 mg) chúng còn được xem là nguyên nhân gây xơ gan và ung thư gan. Còn Ochratoxin A cũng được khuyến cáo gây độc cho thận và được phân loại là chất có khả năng gây ung thư nhóm 2B (Nguyễn Thị Hiền & cs, 2005). Các loại độc tố vi nấm này có thể được sàng lọc nhanh dựa vào tính chất phát huỳnh quang tại bước sóng tử ngoại bằng phương pháp TLC. Kết quả (Hình 1b) cho thấy trong cả 2 dịch chiết enzyme nội và ngoại bào đều không xuất hiện vạch huỳnh quang của các độc tố Aflatoxin B1/ B2/ G1/ G2, Ochratoxin A. Vì vậy chủng này là an toàn cho sử dụng để sinh tổng hợp enzyme GOx.

(a) Hoạt tính GOx thô tổng số		(b) Sắc kí bản mỏng kiểm tra độc tố mycotoxin
Ngoại bào (U)	Nội bào (U)
3,72 ± 0,15	30,20 ± 0,12	M: Độc tố nấm chuẩn       1: Enzyme thô ngoại bào   2: Enzyme thô nội bào

Hình 1. (a) Hoạt tính sinh tổng hợp GOx, (b) Khả năng sinh độc tố mycotoxin của chủng vi nấm nghiên cứu

3.2. Định danh chủng vi nấm MN1 
3.2.1. Dựa trên hình thái học 
 

Hình 2. Đặc điểm hình thái và vi hình thái của chủng MN1 (a) Hình thái khuẩn lạc trên thạch đĩa; (b) Cuống đính bào tử dưới kính hiển vi 40 x

+ Đặc điểm hình thái học khuẩn lạc: Khuẩn lạc ban đầu màu trắng, nuôi lâu chuyển thành màu đen sẫm với kết cấu nhung. Bề mặt dạng bột, lấm tấm, dày đặc, tản nấm phẳng, lan rộng, hơi gồ lên ở giữa. Mặt dưới khuẩn lạc không màu (Hình 2a).

+ Đặc điểm vi hình thái của sợi nấm: Khuẩn ty: Có vách ngăn, mảnh, trong suốt, phân nhánh tạo thành thân chính của nấm. Cuống bào tử đính: dài, nhẵn, có thành dày, không phân nhánh và mọc ra từ sợi nấm, có cấu trúc hình bình ở đỉnh, từ đó sinh ra các chuỗi bào tử. Bọng: Có hình cầu, kích thước 30-70 µm. Các thể bình mọc tỏa ra từ bọng. Bào tử đính: Có hình cầu màu đen, kích thước nhỏ, đường kính 3-5 µm (Hình 2b).
Dựa vào các đặc điểm hình thái kết hợp với khóa phân loại của Ainsworth & cs (1973) nhận thấy chủng MN1 có nhiều đặc điểm giống loài A. niger.

3.2.2. Phương pháp sinh học phân tử

Sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại đoạn gen đặc trưng vùng ITS (Internal Transcribed Spacer - ITS1 - 5.8 rDNA - ITS2). Xây dựng cây phát sinh phả hệ dựa trên so sánh mức độ tương đồng gen ITS của chủng nấm với trình tự đã được công bố trên GenBank.

Hình 3. (a) Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose, (b) Cây phát sinh chủng loại trình tự gen ITS của chủng MN1 so sánh với các chủng có độ tương đồng cao trên Genbank

Kết quả điện di sản phẩm PCR (Hình 3a) cho thấy trên giếng kiểm tra xuất hiện 1 băng đặc hiệu có kích thước phân tử khoảng 500 - 600 bp tương đương với tính toán lý thuyết. Như vậy, đã khuếch đại thành công đoạn gen ITS của chủng nấm cần định danh. Chủng MN1 có trình tự ITS thể hiện độ tương đồng cao (100%) với các chủng A. niger khác trên Genbank (Hình 3b). 

Kết hợp với kết quả định danh truyền thống đã khẳng định được: chủng MN1 có tên phân loại là A. niger MN1

3.3. Lựa chọn phương pháp phá vỡ tế bào giải phóng enzyme

Phá vỡ tế bào để thu hồi enzyme là một bước quan trọng với mục tiêu làm sao vỡ được lớp màng tế bào nhưng không làm biến tính enzyme. Tùy thuộc vào loại tế bào mà cấu trúc thành tế bào có độ bền khác nhau, từ đó lựa chọn được phương pháp phù hợp. 

Kết quả từ bảng 1 cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa 4 phương pháp tách chiết được khảo sát. Tuy nhiên phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm giải phóng nhiều enzyme GOx nội bào nhất (hoạt độ tổng đạt 31,25 U/50 g sinh khối) đồng thời phương pháp này cũng tương đối đơn giản, rẻ tiền, dễ áp dụng, vì vậy phương pháp này được lựa chọn cho những nghiên cứu tiếp theo.

Bảng 1. Hoạt độ enzyme GOx nội bào thô từ 50 ml A. niger MN1 được giải phóng khi sử dụng các phương pháp phá vỡ tế bào khác nhau

3.4. Tinh chế enzyme GOx

(1) Tinh chế sơ bộ để cô đặc dịch chiết và tách enzyme khỏi phần lớn các tạp chất.

Kết tủa bằng muối (NH4)2SO4: Ở một mức bão hòa nhất định, các phân tử nước liên kết với muối, do đó protein lắng xuống (Abelson và cs, 2014). Ly tâm để thu tủa protein (chứa enzyme), sau đó hòa tan lại tủa vào một lượng nhỏ đệm.

Bảng 2. Hoạt độ enzyme GOx nội bào từ A. niger MN1 sau khi kết tủa bằng (NH4)2SO4 ở các mức độ bão hoà khác nhau

Kết quả ở Bảng 2 cho thấy (NH4)2SO4 với độ bão hòa 80% tạo ra hoạt tính GOx cao nhất 19,65 U/mg. Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu do Triana (2012), Singh và Verma (2013) công bố.
+ Khử muối: Tiếp theo quá trình thẩm tách được thực hiện để loại bỏ (NH4)2SO4 trong dịch chiết. 

(2) Tinh chế bậc cao bằng sắc ký

Sử dụng sắc ký trao đổi ion DEAE-Cellulose và sắc ký lọc gel Superdex-75. 

Bảng 3. Tinh chế enzyme GOx từ 50 ml môi trường lên men chủng A. niger MN1

Kết quả tinh chế (Bảng 3) cho thấy độ tinh khiết của GOx qua từng bước tinh sạch tăng lên. Sau mỗi bước, protein tạp bị loại bỏ dần, do đó hoạt độ riêng tăng lên. Hoạt tính đặc hiệu của dịch chiết thô là 0,285 U/mg, đến bước kết tủa (NH4)2SO4 lên 1,454 U/mg, và nó tăng gấp 5,1 lần so với hoạt tính của dịch chiết thô. Quá trình thẩm tách cho độ tinh khiết của mẫu tăng gấp 34,06 lần so với ban đầu. Ở bước sắc ký cột trao đổi ion và sắc ký lọc gel độ tinh khiết của enzyme tiếp tục tăng đáng kể, gấp 61,82 và 83,4 lần so với enzyme thô. Trong hầu hết các nghiên cứu về enzyme từ nấm mốc, mức hệ số tinh sạch từ 50 đến 100 lần thường được coi là đạt tiêu chuẩn rất tốt để thu được enzyme có độ tinh khiết cao. Qua mỗi bước hiệu suất thu hồi giảm dần. Đến bước cuối hoạt độ riêng của enzyme GOx thu được đạt 23,77 U/mg với hiệu suất thu hồi đạt 28,11%.

Hoạt tính riêng của enzyme GOx từ A. niger MN1 đạt 23,77 U/mg nằm ở ngưỡng bán tinh sạch, đã loại bỏ được lượng lớn protein không mong muốn. Các dòng thương mại có hoạt tính cao thường là kết quả của quá trình biến đổi gen (hoạt tính cao gấp nhiều lần chủng dại) và tinh sạch công nghiệp chuyên sâu (sử dụng sắc ký ái lực hoặc nhiều bước sắc ký nối tiếp). 23,77 U/mg là đủ ứng dụng trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm. Việc tinh sạch quá mức sẽ làm chi phí sản xuất vượt quá giá trị kinh tế.

28,11% là hiệu suất cuối cùng sau nhiều bước (như thẩm tách, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel) vì vậy được coi là tốt. Trong các quy trình tinh sạch phức tạp, việc mất mát 70-80% tổng hoạt tính là điều thường thấy, mục tiêu chính ở giai đoạn này là độ tinh khiết hơn là tổng lượng enzyme thu hồi.

3.5. Đánh giá đặc tính của enzyme

(1)    Kích thước khối lượng phân tử, độ tinh sạch của enzyme

Sự tăng độ tinh khiết của enzyme sau mỗi bước tinh sạch cũng được thể hiện trên ảnh điện di biến tính Protein SDS-PAGE (Hình 4). Ở sản phẩm cuối cùng trên gel SDS chỉ cho thấy 1 vạch duy nhất (~ độ tinh khiết > 95%), đó được đánh giá là một sản phẩm tốt dù hoạt tính riêng (U/mg) chưa cao.

GOx từ A. niger là một glycoprotein dimer có khối lượng khoảng 150-160 kDa. Hai tiểu phần monomer được giữ với nhau bằng các liên kết không cộng hóa trị. Quá trình đun mẫu với SDS và chất khử (β-mercaptoethanol) sẽ làm đứt gãy các tương tác giữa các tiểu phần. Dimer sẽ bị phân tách thành 2 monomer. Khi chạy SDS-PAGE cho GOx đạt độ tinh sạch cao sẽ thấy một vạch duy nhất ở vùng 75-80 kDa. Kết quả ở hình 4 cho thấy 1 băng duy nhất nằm giữa 2 vạch marker 75 và 100 kDa như vậy enzyme thu được đúng là GOx.

(2) pH tối ưu, độ bền pH - Nhiệt độ tối ưu, độ bền nhiệt của enzyme

(a)	(b)

Hình 5. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH (a), nhiệt độ (b) lên hoạt tính enzyme

Kết quả hình 5(a) cho thấy enzyme GOx đạt hoạt tính xúc tác cao nhất tại pH 5,5. Hoạt tính giảm mạnh khi dịch chuyển ra xa khoảng pH 4,5 - 6,0. Tại pH 5,5, cấu trúc ion hóa tại trung tâm hoạt động của enzyme được xem là tối ưu nhất cho việc hình thành phức hợp enzyme-cơ chất. Đáng chú ý, độ bền của enzyme có dải ổn định rộng hơn so với khoảng hoạt động tối ưu. Enzyme thể hiện sự bền vững đáng kể trong dải pH từ 4,5 đến 6,0, đặc biệt đạt đỉnh ổn định tại pH 5.0. Sự khác biệt nhỏ giữa pH tối ưu cho hoạt động (5,5) và pH tối ưu cho độ bền (5,0) cho thấy cấu trúc bậc 3 của enzyme được duy trì tốt nhất ở môi trường có tính axit nhẹ hơn một chút so với môi trường xúc tác hiệu quả nhất. pH quá thấp < 3 hoặc quá cao > 7 làm thay đổi trạng thái điện tích của các chuỗi bên axit amin, dẫn đến phá vỡ các liên kết hydro và tương tác tĩnh điện, gây mất cấu hình không gian khiến hoạt tính giảm. Việc GOx từ A. niger có xu hướng ưa axit là đặc điểm sinh học thường gặp, phù hợp với môi trường sống tự nhiên của vi nấm. Độ bền tốt trong dải pH rộng (đặc biệt là pH 4,5-6,0) là một ưu điểm lớn, tạo điều kiện thuận lợi cho việc ứng dụng enzyme vào các quy trình công nghệ thực phẩm hoặc xử lý nguyên liệu có tính axit, giúp enzyme duy trì cấu trúc ổn định lâu dài mà không bị biến tính hóa học nhanh chóng. Kết quả thu được cũng tương đồng với công bố của Anida & cs (2018). Jagdish & Neelam (2013) tìm thấy pH tối ưu ở 5,6 và bền pH trong khoảng 4-6,5.

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính và độ bền của enzyme GOx được trình bày tại Hình 5(b). Có thể thấy, enzyme GOx thuộc loại ưa nhiệt trung bình, đạt hoạt tính tối ưu ở nhiệt độ 35°C. Tuy nhiên, khi xét về độ bền nhiệt, enzyme cho thấy sự ổn định hoàn hảo (100% hoạt tính) trong khoảng 30-35°C. Tại vùng nhiệt độ trên 55°C, độ bền nhiệt giảm nhanh hơn so với hoạt tính tối ưu. Điều này khẳng định rằng nhiệt độ cao không chỉ làm giảm tốc độ va chạm giữa enzyme và cơ chất, mà còn gây ra sự biến tính hoàn toàn đối với cấu trúc bậc 3 của protein. Với dải nhiệt độ tối ưu và độ bền ổn định trong khoảng 30-45°C, enzyme GOx từ A. niger thể hiện tính ứng dụng cao trong các quy trình chế biến thực phẩm ở nhiệt độ vừa phải, giúp tối ưu hóa hiệu suất mà vẫn đảm bảo tính kinh tế, tiết kiệm năng lượng. Moorthi (2019) khi nghiên cứu thu nhận GOx từ A. awamori cũng cho kết quả nhiệt độ tối ưu ở 35oC nhưng độ bền pH có phạm vi rộng hơn từ 20-50oC. 

Với các kết quả này, pH từ 4,5-6 và nhiệt độ từ 30-40°C được xác định là điều kiện làm việc lý tưởng cho enzyme GOx trong các ứng dụng thực tế sử dụng chủng MN1.

(3) Ảnh hưởng của cơ chất 

Đo tốc độ phản ứng ở các nồng độ cơ chất khác nhau (1, 2, 5, 10, 20, 50, 100 mM) để xác định được các thông số động học cơ bản theo Michaelis-Menten.

Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng enzyme GOx vào nồng độ cơ chất glucose đã được khảo sát. Kết quả thực nghiệm (Bảng 4) cho thấy hoạt tính enzyme tuân theo mô hình động học Michaelis-Menten. Bằng phương pháp biểu diễn nghịch đảo kép Lineweaver-Burk, các thông số động học đã được xác định: giá trị Km là 4,99 mM và tốc độ phản ứng cực đại Vmax là 99,0 µmol/phút/mg.

Bảng 4. Dữ liệu đo tốc độ phản ứng ở các nồng độ cơ chất khác nhau

Km của GOx thu được từ MN1 đối với β-D-glucose thấp (trong khoảng 1-10 mM), kết quả này cho thấy enzyme này có ái lực khá tốt với glucose, cho phép nó hoạt động hiệu quả ngay cả khi nồng độ glucose không quá cao. Có thể dùng GOx để phát hiện glucose trong máu (que thử tiểu đường), Km ở mức này là phù hợp vì nó nằm gần nồng độ glucose sinh lý.

(4) Ảnh hưởng của một số ion kim loại và chất ức chế lên hoạt tính enzyme

Bảng 5. Ảnh hưởng của một số ion kim loại/ chất ức chế lên hoạt tính enzyme

Chất ức chế enzyme    AgNO3    CaCl2    CuSO4    ZnSO4    MgSO4    EDTA    L-Cysteine    SDS    Urea
Nồng độ sử dụng    1 mmol/L    0.001 mmol/L    1%    3 mol/L

Hoạt tính còn lại (%)    0    87,5    72,4    80,1    100    74,9    0    49,7    15,5
Kết quả khảo sát sự tác động của các tác nhân hóa học đối với hoạt tính enzyme GOx (Bảng 5) cho thấy mức độ nhạy cảm khác nhau của enzyme trước các điều kiện môi trường. Có sự phân hóa rõ rệt thành ba nhóm tác động chính:

1. Nhóm ức chế hoàn toàn: AgNO3 và L-Cysteine gây mất hoàn toàn hoạt tính enzyme (0%). Đây là kết quả then chốt chứng minh tầm quan trọng của các nhóm -SH và cầu nối disulfide trong việc duy trì cấu trúc dimer ổn định của GOx.

2. Nhóm gây ức chế mạnh: Urea (15,5%) và SDS (49,7%) làm giảm đáng kể hoạt tính, khẳng định enzyme có cấu trúc bậc 3 và bậc 4 rất nhạy cảm với các tác nhân biến tính protein.

3. Nhóm tác động nhẹ hoặc không ảnh hưởng: Mg2+ hoàn toàn không gây ức chế (100%), trong khi Ca2+ và Zn2+ có tác động ức chế không đáng kể (87,5 và 80,1%). Điều này cho thấy enzyme khá bền vững đối với các ion kim loại phổ biến trong môi trường tự nhiên, chỉ bị ảnh hưởng bởi kim loại nặng như Ag+ hoặc Cu2+.

Sự nhạy cảm với L-Cysteine và AgNO3 là bằng chứng thực nghiệm quan trọng nhất, gợi ý rằng quá trình tinh sạch và bảo quản enzyme cần đặc biệt tránh các môi trường khử mạnh hoặc sự hiện diện của kim loại nặng. GOx là một flavoenzyme, không yêu cầu ion kim loại để hoạt động xúc tác trực tiếp (ngoài co-factor FAD), do đó, hầu hết các ion kim loại thường gây ức chế hơn là hoạt hóa.

4. Kết luận

Nghiên cứu đã thành công trong việc thiết lập quy trình thu nhận và tinh sạch GOx từ chủng bản địa A. niger MN1 với hiệu suất và độ tinh sạch cao, cung cấp nguồn enzyme tiềm năng cho các ứng dụng công nghệ sinh học trong nước. Đã thực hiện nghiên cứu đầy đủ các bước từ đặc tính hóa lý (pH, nhiệt độ) đến đặc tính sinh hóa (động học Michaelis-Menten, khả năng sinh độc tố mycotoxin) và cả đánh giá tác động của ion kim loại/ chất ức chế. 

Lời cảm ơn: Nghiên cứu này được hỗ trợ kinh phí từ đề tài Hỗ trợ hoạt động nghiên cứu khoa học cho nghiên cứu viên cao cấp của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, mã số NCVCC 08.07/25-25.

Phạm Thanh Hà^1*, Lê Thị Minh Thành¹, Lê Thị Thanh Xuân¹, Trịnh Thị Thu Hà¹, Phạm Thị Thoan¹, Nguyễn Thị Mai Hương²

¹ Viện Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

² Viện Vật lí, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

(Nguồn: Bài đăng trên Tạp chí Môi trường số Chuyên đề Khoa học - Công nghệ II/2026)

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Abelson NJ, Melvin IS, Anna MP, 2014. Methods in Enzymology. UK: Elsevier. Bankar SB, Bule MV. 2009. Optimization of Aspergillus niger fermentation for the production of glucose oxidase. Food Bioprocess Technol. 2: 344-352. 

2. Aninda I, Laksmi A, Dewi SZ, 2018. Partial Purification and Characterization of Glucose Oxidase from Aspergillus niger IPBCC.08.610. Microbiology Indonesia. 12(2): 43-48.

3. Bodade RG, Khobragade CN, Arfeen S, 2010. Optimization of culture conditions for glucose oxidase production by a Penicillium chrysogenum SRT 19 strain. Engineering in Life Sciences. 10(1): 35-39.

4. Camassola M, Rosa LO, Calloni R, Gaio TA, Dillon AJP, 2013. Secretion of laccase and manganese peroxidase by Pleurotus strains cultivate in solid-state using Pinus spp. Sawdust. Brazilian Journal of Microbiology 44 (1): 207-213.

5. Hatzinikolaou DJ, Macris BJ, 1995. Factors regulating production of glucose oxidase by Aspergillus niger. Enzyme and Microbial Technology. 17(6): 530-534.

6. Jagdish S, Neelam V, 2013. Glucose oxidase from Aspergillus niger: Production, characterization, and immobilization for glucose oxidation, Advances in Applied Science Research. 4 (3): 250-257. 

7. Kristensen SR, 1994. Mechanisms of cell damage and enzyme release. Department of
Clinical Chemistry, Odense University Hospital. 41 (4): 423-433.

8. Liu JZ, Yang HY, Weng LP, Ji LN, 1999. Synthesis of glucose oxidase and catalase
by Aspergillus niger in resting cell culture system. Letter in Applied Microbiology. 29
(5): 337-341.

9. Meyer V, 2008. Genetic engineering of filamentous fungi-progress, obstacles and future trends. Biotechnol Adv. 26(2): 177-185. 

10. Moorthi S, 2009. Optimization, characterization and applications of glucose oxidase produced from Aspergillus awamori mtcc 9645 for food processing and preservation. Chennai (IN): Educational and Research Institute University. 

11. Nguyễn Thị Hiền, Phan Thị Kim, Trương Thị Hòa, Lê Thị Lan Chi, 2005. VSV nhiễm tạp
trong lương thực, thực phẩm, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

12. Petruccioli M, Ceccarelli M, Federici F, 1993. Screening of Penicillium species for the production of extracellular glucose oxidase. World J Microbiol Biotechnol. 9(1): 77-79. 

13. Pluschkell  S, Hellmuth K, Rinas U, 1996. Kinetics of glucose oxidase excretion by recombinant Aspergillus niger. Biotechnol Bioeng. 51(2): 215-220.

14. Sabir S, Bhatti HN, Zia MA, Sheikh MA, 2007. Enhanced Production of glucose oxidase using Penicillium notatum and rice polwash. Biotechnol. 45: 443-446. 

15. Simpson C, Jordaan J, Gardiner NS, Whiteley. 2007. Isolation, purication and characterization of a novel glucose oxidase from Penicillium sp. CBS 120262 optimally active at neutral pH. Protein Expression and Purification. 51: 260-266. 

16. Singh J, Verma N. 2013. Glucose oxidase from Aspergillus niger: production, characterization and immobilization for glucose oxidation. Adv Appl Sci Res. 4: 250-257. 

17. Tang HO, Yao B, Gao X, Yang P, Wang Z, Zhang G, 2016. Effects of glucose oxidase on the growth performance, serum parameters and faecal microflora of piglets. S. Afr. J. Anim. Sci. 46:14-20.

18. Triana R, 2012. Pemurnian dan karakterisasi enzim glukosa oksidase dari isolat lokal Aspergillus niger (IPBCC.08.610). Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. 

19. Vitolo M., 2021. Enzymes: the catalytic proteins. Pharmaceutical Biotechnology. CRC Press, 257-263.

20. Yoo EH, Lee SY, 2010. Glucose biosensors: an overview of use in clinical practice. Sensors. 10(5): 4558-4576.

21. Zia MA, Rahman KU, Saeed MK, Andaleeb F, Rajoka MI, Sheikh MA et al. 2007. Thermal characterization of purified glucose oxidase from a newly isolated Aspergillus niger UAF-1. J Clin Biochem Nutrit. 41(2): 132-138.