Tính kháng kháng sinh của E.coli trong nước sông Sài Gòn ở vùng đô thị

01/12/2022

Tóm tắt:

    Ngày nay, sự phát triển và lan rộng của kháng kháng sinh đã trở thành một vấn đề môi trường đáng quan tâm do bị ảnh hưởng bởi việc sử dụng kháng sinh nhiều hơn mức cần thiết. Sự xuất hiện của vi khuẩn kháng thuốc là ngày càng nhiều trong nước bề mặt. Nghiên cứu này nhằm mục đích đánh giá tính kháng kháng sinh của E.coli trong nước sông Sài Gòn trong khu vực đô thị đối với Ciprofloxacin và Ofloxacin. Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng nước sông Sài Gòn trong khu vực đô thị bị ô nhiễm E.coli rất cao và các nhóm E.coli có tính kháng kháng sinh đối với Ciprofloxacin và Ofloxacin. Kết quả thử nghiệm cho thấy có tới 90% mẫu thử có đường kính vùng nhỏ hơn 15mm đối với Ciprofloxacin và 12mm đối với Ofloxacin.

    Từ khóa: Kháng kháng sinh, E.coli, sông Sài Gòn, vùng đô thị.

    Nhận bài: 15/11/2022; Sửa chữa: 22/11/2022; Duyệt đăng: 25/11/2022.

    1. Giới thiệu

    Một vi khuẩn được gọi là đề kháng khi nồng độ ức chế tối thiểu (minimal inhibitory concentration, MIC) của vi khuẩn đó là cao hơn nồng độ ức chế đa số các chủng vi khuẩn khác của cùng loài đó. Theo khái niệm được đưa ra bởi Tổ chức Y tế Thế giới “Kháng kháng sinh (AMR) - khả năng của vi sinh vật (vi khuẩn, vi rút, nấm, ký sinh trùng) chống lại tác dụng của thuốc” [1], sự kháng kháng sinh phát triển nhanh và được giới thiệu như là một “kháng sinh mới” [2]. Trong nước, sự tồn tại của dư lượng kháng sinh đã có những tác động tiêu cực như tính kháng kháng sinh của vi khuẩn [3], ức chế hoạt động của vi sinh vật [4], gây rủi ro hệ sinh thái nước [5], làm tổn thương nguồn nước mặt do tiếp nhận chất kháng sinh... Bất kỳ việc sử dụng chất kháng sinh nào cũng có thể dẫn đến sự xuất hiện của các vi sinh vật kháng thuốc và có thể lây lan trực tiếp sức đề kháng từ môi trường nước sang người và phát triển tính đề kháng của vi khuẩn trong môi trường nước [6].

    Một số nghiên cứu về sự kháng kháng sinh của vi khuẩn trong các nguồn nước đã cho thấy là nước càng bẩn thì nồng độ vi khuẩn kháng kháng sinh càng cao. Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ trung bình của tổng vi khuẩn kháng kháng sinh (antimicrobial resistance bacteria, ARB) trong nước thải sinh hoạt (5,94.10⁵ CFU/mL), nước thải bệnh viện (1,40.10⁵ CFU/mL) cao hơn 2-3 lần so với nước ngọt (5,14.10² CFU/mL) [7]. Kết quả nghiên cứu cho thấy, nước ngọt có nồng độ vi khuẩn kháng amikacin thấp hơn đáng kể (2,97.10¹ CFU/mL), ceftazidime (5,83.10² CFU/mL), clindamycin (1,62.10³ CFU/mL), erythromycin (1,57.10³ CFU/mL), cotrimoxazole (1,92.10¹ CFU/mL), tetracycline (3,30.10² CFU/mL), chloramphenicol (1,95.10¹ CFU/mL) và vancomycin (9,36.10² CFU/mL). Với độ tin cậy 95% (t-test, P <0,05), sự khác biệt về nồng độ vi khuẩn kháng kháng sinh trong nước thải sinh hoạt và bệnh viện là không đáng kể, ngoại trừ kháng sinh vancomycin, trong đó nước thải sinh hoạt cao hơn một bậc (1,15.10⁶ CFU/mL) [8].

    Tính kháng kháng sinh của E. coli trong các mẫu nước nước mặt và nước ngầm được phân lập gần các chuồng bò ở Mỹ cũng đã cho thấy 34/80 chủng (42,5%) kháng với một hoặc nhiều loại kháng sinh và 22/80 chủng E. coli (27,5%) kháng đa kháng sinh (kháng với ≥3 loại kháng sinh)… [9]. Có sự tương quan thuận đáng kể giữa tính kháng kháng sinh với nồng độ kháng sinh trong nước tương ứng giữa chúng như tương quan giữa ciprofloxacin và gen qnrS (r = 0,86, p = 0,001), ofloxacin và gen qnrS (r = 0,81, p = 0,001), cefazolin và gen blaTEM (r = 0,84, p = 0,001), cefotaxime và gen blaTEM (r = 0,74, p = 0,002), clarithromycin và gen ermB (r = 0,89, p = 0,001), và sulfamethoxazole và gen sulI (r = 0,83, p = 0,001) [10]. Chính sự hình thành các vi khuẩn có tính kháng kháng sinh trong nước mà giảm sự tác dụng của thuốc nên hàng năm có khoảng 700.000 người chết trên toàn thế giới [11] do nhiễm trùng, do tiêu thụ sản phẩm thủy sản, do nước uống, tiếp xúc với nước hoặc các sinh vật thủy sinh và một trong những vi khuẩn kháng kháng sinh nhiều nhất là có E.coli [12].

    Sông Sài Gòn chảy qua khu vực nội thành chịu nhiều tác động bởi nước thải sinh hoạt, nước thải công nghiệp, nước thải bệnh viện và dược phẩm, chất thải rắn nên có mức độ ô nhiễm cao về vi sinh vật và chất kháng sinh. Để đánh giá mức độ tác động của chất kháng sinh đến môi trường nước sông Sài Gòn ở vùng đô thị, nghiên cứu về tính kháng kháng sinh của E.coli đối với Ciprofloxacin và Ofloxacin là đã được nghiên cứu.

    2. Nguyên liệu và phương pháp

    2.1. Vị trí thu mẫu và thu mẫu

    Để đánh giá mức độ ô nhiễm và kiểm tra tính nhạy cảm đối với Escherichia coli (E.coli) trong nước sông Sài Gòn ở vùng đô thị, các điểm được lựa chọn là bến Bạch Đằng, cầu Thanh Đa và cầu Bình Phước.

    Mẫu nước E.coli được lấy trực tiếp từ nước mặt sông Sài Gòn và được chứa vào chai thủy tinh chứa mẫu, đã hấp khử trùng ở (121 ± 3^oC trong 15 phút. Các bước lấy mẫu và bảo quản mẫu đều được thực hiện theo hướng dẫn của TCVN 8880:2011.

    2.2. Nguyên liệu

    Escherichia coli được phân lập từ các mẫu nước sông Sài Gòn ở vùng đô thị.

    Chất kháng sinh Ciprofloxacin và Ofloxacin: sử dụng chất chuẩn 5µg của Công ty Nam Khoa.

	Ciprofloxacin	Ofloxacin
Công thức cấu tạo:	C17H18FN3O3	C18H20FN3O4.
Công thức phân tử

    ​2.3. Phương pháp

• Phương pháp xác định mật độ E.coli: Sử dụng phương pháp phát hiện và đếm Escherichia coli bằng phương pháp màng lọc, thực hiện theo QCVN 6187-1:2009.

Hình 1. Kỹ thuật về dĩa đọc đường kính vùng ức chế dạng nhỏ	Hình 2. Khuẩn lạc E.coli trên EMB

• Phương pháp xác định tính kháng kháng sinh của E.coli trong nước: Sử dụng phương pháp nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán theo tài liệu hướng dẫn của Viện Tiêu chuẩn Phòng thí nghiệm và Lâm sàng Mỹ [13] và tham khảo các nghiên cứu liên quan. Các bước được tiến hành như sau:

• Sử dụng chủng chuẩn E.coli ATCC 25922.

• Đĩa thạch Mueller – Hinton: Sử dụng thạch Mueller - Hinton có sẵn.

Hình 3.  Quy trình thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh bằng kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán [13]

    Khi sử dụng, nếu mặt thạch ướt thì phơi các đĩa thạch trong tủ ấm (35 - 37⁰C) khoảng 15 - 30 phút. Không mở nắp đĩa thạch khi phơi để tránh bị nhiễm.

• Kiểm tra pH của môi trường trước khi đổ đĩa, pH phải nằm trong khoảng 7,2 - 7,4.

• Chuẩn bị chủng vi khuẩn và Pha hỗn dịch vi khuẩn.

• Láng vi khuẩn lên đĩa thạch.

• Đặt khoanh giấy kháng sinh: sử dụng chất kháng sinh với hàm lượng 5µ theo đúng hướng dẫn [13].

• Đọc và phân tích kết quả.

• Sau khi ủ ấm lấy các đĩa thạch ra khỏi tủ ấm. Đo và ghi lại kích thước vòng vô khuẩn (dùng thước đo từ mặt sau của đĩa và không được mở nắp) của chủng chuẩn.

    Bảng 1. Tiêu chuẩn đọc kết quả đường kính vùng ức chế và nồng độ ức chế tối thiểu

Kháng sinh	Hàm lượng	Giới hạn đường kính vùng ức chế (mm)			Giới hạn nồng độ ức chế tối thiểu (μg/mL)
		S	I	R	S	I	R
Ciprofloxacin	5 μg	≥ 21	16 - 20	≤ 15	≤ 1	2	≥ 4
Ofloxacin	5 μg	≥ 16	13 - 15	≤ 12	≤ 2	4	≥ 8

    Ghi chú: S: nhạy cảm (Susceptible), I: trung tính (Intermediate), R: kháng (Resistant).

• Xác nhận độ đúng và độ chính xác về tính kháng kháng sinh của E.coli: Theo quy định của Viện Tiêu chuẩn lâm sàng và Xét nghiệm Mỹ [13], đối với thí nghiệm khoanh giấy khuếch tán, kỹ thuật soi đĩa trên nền đen với ánh sáng xuyên qua, ranh giới vùng ức chế có thể phát hiện bằng mắt thường, có thể bỏ qua sự phát triển yếu tố sai số do ánh sáng (không quá 20%).

    Số lần thí nghiệm kiểm chứng: 12 thí nghiệm.

    Độ chính xác 85% (P = 0,85): tính toán và xử lý thống kê số liệu thực nghiệm [14].

	(1)
Suy ra:	(2)

Điều kiện: KTC  15% do đó:                                                  

Trong đó:

X: hàm lượng chất kháng sinh (Ciprofloxacin hoặc Ofloxacin) (5µg).

S: Độ lệch chuẩn của các kết quả đã phân tích cho

t: Giá trị chuẩn Student theo xác suất p = % với tần suất f = n-1

n: Số lần thí nghiệm (12 lần)

    3. Kết quả và thảo luận

    3.1. Kết quả phân tích E.coli tại sông Sài Gòn trong vùng nội thị

Hình 4. Diễn biến E.coli tại các điểm khảo sát vùng đô thị sông Sài Gòn

    Cầu Bình Phước: Trong ba lần khảo sát sự hiện diện của E.coli tại cầu Bình Phước thì tỷ lệ hiện diện của E.coli là 100%, số lượng lần lượt là 110.000 MPN/100mL, 120.000 MPN/100mL, 150.000 MPN/100mL.

    Bến Bạch Đằng: Trong ba lần khảo sát, sự hiện diện của E.coli tại Bến Bạch Đằng thì có 2 lần có sự hiện diện của E.coli, cho số lượng E.coli lần lượt là 100.000 MPN/100mL và 40.000 MPN/100mL.

    Cầu Thanh Đa: Trong ba lần khảo sát sự hiện diện của E.coli tại cầu Thanh Đa thì chỉ có 1 lần có sự hiện diện của E.coli, cho số lượng E.coli là 60.000 MPN/100mL.

• Nhận xét về mật độ E.coli ở sông Sài Gòn vùng nội thị:

    Ở cầu Bình Phước, đây là nơi ô nhiễm nhất trong 3 vị trí khảo sát tại sông Sài Gòn trong khu vực nội thị (tần suất hiện diện E.coli trong 3 lần khảo sát ở đây là 100%). Theo kết quả cho thấy lượng E.coli tại đây có hiện tượng tăng liên tục nên sự ô nghiễm ở đây càng ngày càng nặng.

    Ở bến Bạch Đằng, đây là nơi ô nhiễm thứ 2 trong 3 vị trí khảo sát, tần suất hiện diện của E.coli ở đây là 2/3 lần khảo sát. Theo kết quả nghiên cứu cho thấy tại bến Bạch Đằng sự nhiễm E.coli là khá thất thường.

    Ở cầu Thanh Đa, đây là địa điểm ít ô nhiễm nhất trong 3 nơi được khảo sát, tần suất hiện diện của E.coli là 1/3 lần khảo sát, có thể do dòng chảy mạnh ở khu vực này nên tần suất hiện diện của E.coli là thấp hơn.

    Xét một tổng thể, các kết quả nghiên cứu là chưa thể đưa ra được một quy luật chứng minh rằng sự biến động của mật độ E.coli ở khu vực nội thị sông Sài Gòn là do yếu tố xả thải chất ô nhiễm hoặc mức độ ô nhiễm sinh hóa thông thường mà có thể do một yếu tố có tính độc hại hoặc nhạy cảm với E.coli do đó cần phải có một nghiên cứu sâu hơn về mối tương quan này.

    ​3.2. Tính kháng kháng sinh của E.coli đối với Ciprofloxacin và Ofloxacin

Hình 5. Diễn biến tương đối giữa nồng độ Ciprofloxacin và Ofloxacin với mật độ E.coli tại các điểm lấy mẫu

tại cầu Bình Phước và bến Bạch Đằng

    Kết quả phân tích chứng minh một cách tương đối rằng, nồng độ Ciprofloxacin và Ofloxacin càng cao thì mật độ E.coli trong nước sông càng giảm. Điều này có thể phỏng đoán rằng, Ciprofloxacin và Ofloxacin có khả năng giảm sự phát triển đối với E.coli trong nước sông Sài Gòn.

    Kết quả đánh giá tính kháng kháng sinh của E.coli đối với Ciprofloxacin và Ofloxacin như sau:

    ​Bảng 2. Sự ức chế của kháng sinh Ciprofloxacin và Ofloxacin đối với E.coli

Địa điểm khảo sát	Kết quả đường kính vùng ức chế đối với Ciprofloxacin và Ofloxacin (mm)
	Đối với Ciprofloxacin			Trung bình	Đối với Ofloxacin			Trung bình
	Lần 1	Lần 2	Lần 3		Lần 1	Lần 2	Lần 3
Bến Bạch Đằng	11	5	8	8	10	8	11	10
Cầu Thanh Đa	7	13	13	11	6	5	9	7
Cầu Bình Phước	18	12	6	12	7	12	3	7
S: nhạy cảm (Susceptible)				≥ 21				≥ 16
I: trung tính (Intermediate)				16-20				13-15
R: kháng (Resistant)				≤ 15				≤ 12
Kết quả tính toán thống kê các kết quả xét nghiệm về sự ức chế đối với E.coli:
Đường kính trung bình vùng ức chế (X):				10,3				7,9
Độ lệch chuẩn (S):				4,18				2,93
Điều kiện KTC ≤ 15% (sai số <15%)				1,55				1,18

    Nhận xét:

    Kết quả nghiên cứu đã cho thấy sự ảnh hưởng của kháng sinh Ciprofloxacin đến vi khuẩn E.coli là không đáng kể, do E.coli có khả năng kháng kháng sinh Ciprofloxacin rất cao, đặc biệt khả năng kháng cao ở khu vực bến Bạch Đằng thể hiện qua đường kính vùng ức chế chất kháng sinh rất ngắn (5 - 11 mm). Kết quả nghiên cứu này cũng cho thấy phù hợp với các nghiên cứu khác, cho thấy khả năng kháng kháng sinh rất cao của E.coli đối với kháng sinh Ciprofloxacin [1].

    Chỉ duy nhất vị trí cầu Bình Phước có một đợt khảo sát có đường kính vùng ức chế chất kháng sinh khoảng 18 mm, thuộc loại trung tính. Không xảy ra hiện tượng nhạy cảm kháng sinh đối với Ciprofloxacin.

    Đối với Ofloxacin, tính kháng kháng sinh của E.coli cao hơn hẳn. Kết quả nghiên cứu cho thấy, đường kính vùng ức chế tại các điểm khảo sát thuộc 03 khu vực nghiên cứu là rất ngắn (3 - 10 mm, trung bình khoảng 7,9 mm) và tất cả đều nằm trong vùng ức chế kháng sinh.

    Các kết quả thử nghiệm cho thấy, E.coli trong nước sông Sài Gòn thuộc loại kháng kháng sinh đối với cả Ciprofloxacin và Ofloxacin với đường kính vùng ức chế kháng sinh trung bình của Ciprofloxacin (10,3 mm) và Ofloxacin (7,9 mm). Kết quả của nghiên cứu cũng tương đối phù hợp với các nghiên cứu liên quan về tính kháng sinh của E.coli đối với Ciprofloxacin và Ofloxacin [9].

    Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy không có sự tương quan giữa nồng độ E.coli với tính kháng kháng sinh của E.coli đối với Ciprofloxacin và Ofloxacin thông qua xét nghiệm vùng ức chế kháng sinh. Kết quả nghiên cứu này cũng cho thấy sự khác biệt về mối tương quan giữa tính kháng sinh với mức độ ô nhiễm trong nước sông so với nước thải bệnh viện [7].

    3.3. Kết quả kiểm tra về độ đúng của thử nghiệm tính kháng kháng sinh của E.coli

    Vì chỉ biết độ lệch chuẩn S (n = 12 lần thử nghiệm vùng ức chế đối với đối với Ciprofloxacin và Ofloxacin) nên phép tính “n” ở đây chỉ là gần đúng. Kết quả tính toán về đánh giá độ đúng của các thí nghiệm như sau:

    Bảng 3. Thống kê kết quả đánh giá độ đúng của các thử nghiệm vùng ức chế đối với Ciprofloxacin và Ofloxacin

Chất kháng sinh	n (số lần thí nghiệm)		t(0,85,f)		S/X.0,15
Ciprofloxacin	6	2,45	1,156	2,12	2,70
	7	2,65	1,134	2,29	2,70
	8	2,83	1,119	2,55	2,70
	9	3,00	1,108	2,71	2,70
	10	3,16	1,100	2,87	2,70
	11	3,32	1,093	3,03	2,70
	12	3,46	1,088	3,18	2,70
Ofloxacin	6	2,45	1,156	2,12	2,48
	7	2,65	1,134	2,33	2,48
	8	2,83	1,119	2,53	2,48
	9	3,00	1,108	2,71	2,48
	10	3,16	1,100	2,87	2,48
	11	3,32	1,093	3,03	2,48
	12	3,46	1,088	3,18	2,48

    Kết quả tính toán cho thấy, với 09 lần thử nghiệm đối với Ciprofloxacin và 08 lần đối với Ofloxacin thì đảm bảo độ đúng về thử nghiệm vùng kháng sinh. Trong nghiên cứu, thử nghiệm đánh giá vùng kháng sinh của Ciprofloxacin và Ofloxacin đối với E.coli là 12 lần là đảm bảo độ đúng với độ chính xác ít nhất 85% (xác suất P = 0,85).

    Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu và tính toán thống kê có thể khẳng định E.coli trong nước sông Sài Gòn chảy qua khu vực nội thị (khu vực cầu Bình Phước - cầu Thanh Đa - bến Bạch Đằng) có đặc tính là kháng kháng sinh. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy không có sự tương quan giữa tính kháng kháng sinh của E.coli đối với Cyprofloxacin và Ofloxacin. Điều này có thể do khả năng thích nghi với môi trường nước có kháng sinh của E.coli là độc lập và kết quả nghiên cứu là phù hợp về đánh giá rủi ro ô nhiễm nước mặt bởi E.coli [15] và đặc tính kháng kháng sinh của E.coli [9].

    Kết luận

    Dựa vào kết quả nghiên cứu về tính kháng kháng sinh của E.coli đối với kháng sinh Cyprofloxacin và Ofloxacin trên sông Sài Gòn ở vùng đô thị, có thể đưa ra một số kết luận sau:

    Mức độ ô nhiễm vi khuẩn E.coli trên sông Sài Gòn trong khu vực nội thị là rất cao với mật độ E.coli là cao hơn gấp nhiều lần so với giá trị giới hạn của QCVN 08-MT:2015/BTNMT (cột B1, quy định tối đa 200 MPN/100 mL).

    Vi khuẩn E.coli trong nước sông Sài Gòn ở vùng đô thị là có tính kháng kháng sinh đối với Cyprofloxacin và Ofloxacin. Điều này chứng tỏ rằng, nồng độ Ciprofloxacin và Ofloxacin trong nước sông Sài Gòn là cao.

    Khuyến nghị: Cần có nghiên cứu sâu hơn về tính kháng sinh sinh của các loại vi khuẩn đối với tổng thể các loại kháng sinh có trong nước sông Sài Gòn ở những vùng có mục đích sử dụng nước khác nhau.

Nguyễn Thị Thịnh¹, Nguyễn Phú Bảo^{2, 3*}

¹ Viện Kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh

² Trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh

³ Viện Nhiệt đới môi trường

(Nguồn: Bài đăng trên Tạp chí Môi trường, số Chuyên đề Tiếng việt IV/2022)

Antibiotic resistance of E.coli in Saigon river water within urban areas Nguyen Thi Thinh1, Nguyen Phu Bao2, 3* 1 Ho Chi Minh City Drug Testing Institute 2 Ho Chi Minh City University of Technology 3 Viet Nam Institute fot Tropical Technology and Environmental Protection     Abstract: Today, development and spread of antimicrobial resistance has become an interesting environmental problem that is impacted by antimicrobial usage more than necessary. Occurrenced of antimicrobial resistance bacteria was more and more in the surface water. This study aims at assessing antimicrobial resistances of E.coli in  the Saigon River water within urban areas for Ciprofloxacin and Ofloxacin. Results of research has been found out that the Saigon River water within the urban areas is highly polluted with E.coli and that the E.coli groups are antimicrobial resistantce to Ciprofloxacin and Ofloxacin. Experimental results show up to 90% of test samples with zone diameters less than 15mm for Ciprofloxacin and 12mm for Ofloxacin.     Keywords: Antimicrobial resistance, E.coli, the Saigon river, urban areas.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

(1) WHO (World Health Organization), “Antimicrobial resistance Global Report on Surveillance,” WHO Press (ISBN 978 92 4 156474 8), Geneva, 2014.

(2) EMEA, “Antibiotics Resistance in the European Union Associated with Therapeutic use of Veterinary Medicines,” 1999.

(3) Johan Bengtsson-Palme and D.G. Joakim Larsson, “Regulation, Concentrations of antibiotics predicted to select for resistant bacteria: Proposed limits for environmental,” Environment International, vol. 86, pp. 140 - 149, 2016.

94) Marjan Akhyany, Effects of individual antibiotics and their mixtures on single bacterial species, artificial and natural microbial communities., Department of Biological and Environmental Sciences University of Gothenburg, 2013.

(5) Margot Andrieu, Andreu Rico, Tran Minh Phu, Do Thi Thanh Huong, Nguyen Thanh Phuong and Paul J. Van den Brink, “Ecological risk assessment of the antibiotic enrofloxacin applied to Pangasius catfish farms in the Mekong Delta, Vietnam,” Chemosphere, vol. 119, pp. 407 - 414, 2015.

(6) Food and Agriculture Organization (FAO), World Health Organization (WHO) and World Organisation for Animal Health (OIE), “Non-Human Atimicrobial Usaga and Antimicrobial Resistance: Management options,” World Health Organization, Oslo, Norway, 2004.

(7) MOH (Ministry of Health Singapore), “One Health Report on Antimicrobial Utilisation and Resistance, 2017,” Singapore, 2019.

(8) Adrian Low, Charmaine Ng and Jianzhong He, Identification of antibiotic resistant bacteria community and a GeoChip based study of resistome in urban watersheds, Water Research, 2016, pp. 330 - 338.

(9) Xunde Li, Naoko Watanabe, Chengling Xiao, Thomas Harter, Brenda McCowan, Yingjia Liu and Edward R. Atwill, “Antibiotic-resistant E. coli in surface water and groundwater in dairy operations in Northern California,” Environmental Monitoring and Assessment, vol. 186, p. 1.253 - 1.260, 2014.

(10) Sara Rodríguez-Mozaz, Sara Chamorro, Elisabet Marti, Belinda Huerta, Meritxell Gros, Alexandre Sànchez-Melsió, Carles M. Borrego, Damià Barceló and Jose Luis Balcázar, “Occurrence of antibiotics and antibiotic resistance genes in hospital and urban wastewaters and their impact on the receiving river,” Water Research, vol. 69, pp. 234 - 242, 2014.

(11) Isabella Sanseverino, Anna Navarro Cuenca, Robert Loos, Dimitar Marinov and Teresa Lettieri, “State of the Art on the Contribution of Water to Antimicrobial Resistance,” European Union, Luxembourg, 2018.

(12) WHO (World Health Organization), “Global Principles for the Containment of Antimicrobial Resistance in Animals Intended for Food,” World Health Organization (WHO), Geneva, 2000.

(13) CLSI (Clinical and Laboratory Standard Institute), Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement, M100-S21. Vol. 31 No. 1, Vols. Vol. 30 No. 15 (Table 2B-1), ISSBN 1-56238-742-1, 2011.

(14) Cù Thành Long, Giáo trình Xử lý thống kê trong thực nghiệm hóa học, Thành phố Hồ Chí Minh: Đại học Tổng hợp, 1991.

(15) A.J.A. Vinten, J.T. Douglas, D.R. Lewis, M.N. Aitken and D.R. Fenlon, “Relative risk of surface water pollution by E. coli derived from faeces of grazing animals compared to slurry application,” Soil Use and Management, vol. 20, pp. 13 - 22, 2004